X
تبلیغات
زیست شناسی علم زندگی

زیست شناسی علم زندگی

وسترن بلات

وسترن بلات یکی از متدهای ایمنواسی میباشد که برای آشکار سازی پروتئین در بافتها و مایعات مختلف کاربرد دارد. این روش یک روش ترکیبی از الکتروفورز و انتقال پروتئین ها به یک فاز جامد میباشد. وسترن بلات اغلب به عنوان یک روش برای بررسی و تائید حضور یک آنتی بادی در بدن برای تائید بیماری هایی مانند ایدز و یا بیماری لایم میباشد. برای انجام این تست نمونه به صورت یک لکه در انتهای لایه ژل قرار داده میشود. معمولا نمونه ها و کنترل با رعایت فاصله مناسب در کنار هم قرار داده میشوند. پروتئین موجود در نمونه تحت جریان الکتریکی که در محیط ایجاد میشود بر اساس سایز از یکدیگر جدا شده و باندهایی را بر روی این لایه ژل ایجاد میکنند. سپس این نوار های ایجاد شده از نمونه و کنترل به یک غشا نیتروسلولز از طریق تماس غشا با ژل انتقال داده میشود و در نهایت برای آشکارسازی پروتئین های موجود در نمونه که به غشا اتصال پیدا کرده­اند از آنتی بادی نشانه دار ضد پروتئین مورد نظر استفاده میشود. برای مثال برای تائید بیماری ایدز بعد از جداسازی پروتئین ها و انتقال به غشا آنتی بادی نشاندار علیه آنتی بادی ساخته شده در بدن انسان به غشا اضافه کرده و در انتها از مقایسه باندهای آشکار شده با الگوهای حاصل از کنترل مثبت و منفی به تائید بیماری و یا رد آن میپردازند.

این روش آزمایشگاهی دارای ۳ مرحله است:

اول انتقال به ژل الکتروفورز

 دوم انتقال به غشاء نیتروسلولز

 سوم شناسایی پروتئین اختصاصی

ابتدا پروتئین‌های تفکیک شده بر روی ژل الکتروفورز به غشاء منتقل می‌شود. سپس از پادتن‌ها (آنتی بادی‌ها) برای مشخص کردن پروتئین‌ها استفاده می‌شود.

انتقال

در این مرحله پروتئین را از ژل به غشای نیتروسلولزی یا پلی وینیلیدین دی فلوراید (PVDF) منتقل می­کنیم. بدین منظور غشا روی ژل قرار گرفته و از کاغذهای فیلتر هم استفاده می­شود. به دو روش این کار را انجام می­دهیم:

1.     غیرفعال: ساندویچی از ژل، غشا و کاغذهای فیلتری را در محلول بافر قرار می­دهیم. در این روش حرکت موئین باعث می­شود پروتئین­ها به سمت کاغذ نیتروسلولزی حرکت کرده و بنابراین به غشا منتقل شوند. این روش بسیار زمان­بر است و برای انتقال کامل پروتئین 1 تا 2 روز زمان لازم است.

2.     فعال: این روش سریع­تر و کارآمدتر است و در آن از جریان الکتریکی استفاده می­شود و پروتئین­های با بار منفی به سمت قطب مثبت حرکت کرده به غشا وارد می­شوند. به این روش الکتروبلاتینگ می­گویند.

چند نکته در مورد غشا:

برای بررسی پروتئین­های با وزن ملکولی کمتر از  KD10 از غشای نیتروسلولزی استفاده می­شود زیرا ظرفیت اتصال خیلی بیشتر است. در ضمن غشاهای نیتروسلولزی ارزان­ترند، اما شکننده­تر بوده و برای تکرارهای بعدی دوام نمی­آورند. اما PVDF ضخیم­تر و در طی استفاده نسبت به آسیب مقاوم­تر است. در ضمن قبل از استفاده از PVDF باید آن­را در اتانول 95%، ایزوپروپانول و یا متانول بخیسانیم.

وسترن بلات

بررسی انتقال پروتئین به غشا

بایستی غشا را با کوماسی برلیانت بلو یا ponceau S رنگ کنیم. رنگ ponceau S معمول­تر است زیرا حساستر است و بهتر در آب حل می­شود بنابراین رنگ زدایی آن آسان­تر است. پس از آن­که از انتقال پروتئین­ها مطمئن شدیم غشا را با dd H2O شستشو می­دهیم.

بلوکه کردن

از آن­جایی­که غشا توانایی اتصال به پروتئن­ها را دارد و هم هدف ما و هم آنتی­بادی­ها پروتئینی هستند بایستی از برهمکنش بین غشا و آنتی­بادی جلوگیری شود. بنابراین باید تمامی جاهای خالی غشا را بپوشانیم. بدین منظور از TBS حاوی آلبومین سرم گاوی (BSA) 5% یا شیر خشک بدون چربی با درصد ناچیزی شوینده مثل توئین 20 یا تریتون X100  استفاده می­کنیم. بایستی در دمای اتاق و به مدت 30 تا 60 دقیقه در این بافر بماند.

با این عمل آنتی­بادی­ها تنها به مکان­های اتصالی پروتئین­های هدف می­چسبد.

شناسایی

در این فرآیند از آنتی­بادی­های اولیه و ثانویه برای شناسایی پروتئین هدف استفاده می­شود که شامل دو مرحله می­باشد.

ابتدا باید بافری حاوی رقت مناسبی از آنتی­بادی اولیه را جایگزین محلول بلاکینگ کنیم ( از محلول بلاکینگ می­شود چندین بار استفاده کرد. ). به طور معمول این محلول حاوی buffered saline با درصد کمی شوینده و گاهی شیرخشک یا BSA است. در طول این مدت باید محلول را به آرامی تکان دهیم. در ضمن قبل از این مرحله باید صفحه­ی نیتروسلولزی به صورت نوارهایی بریده شود.

مجموعه­ی آنتی­بادی- آنتی­ژن در این مرحله قابل رویت نیست.

سپس غشا را شستشو می­دهیم تا آنتی­بادی­های اولیه که به پروتئین هدف متصل نشده­اند برداشته شوند و سپس آن­را در معرض آنتی­بادی ثانویه به مدت 30 دقیقه قرار می­دهیم. آنتی­بادی ثانویه از منابع حیوانی به­دست می­آید .(anti mouse, anti gout,…) پس از این مرحله نیز سه بار و هر بار به مدت 10 دقیقه غشا را در TBS  شستشو می­دهیم تا آنتی­بادی­های ثانویه که به آنتی­بادی­های اولیه متصل نشده­اند برداشته شوند.  

انواع روش­های تشخیصی

1.     تشخیص رنگ سنجی: در این روش آنتی­بادی ثانویه­ متصل به آنزیم در معرض یک سوبسترا قرار می­گیرد. این سوبسترا با آنزیم (مثل پراکسیداز) واکنش می­دهد و رنگ قابل حل به غیرقابل حل تبدیل شده و در کنار آنزیم رسوب می­کند، بنابراین غشا رنگ می­شود. سطوح پروتئینی توسط چگالی سنجی و یا از طریق اسپکتروفتومتری ارزیابی می­شوند.

2.     تشخیص کمی­لومینسنت: در این روش هنگامی­که سوبسترا در معرض آنزیم قرار می­گیرد لومینسنس تولید می­کند. سپس نور تولیدشده توسط فیلم عکاسی و اخیرا بیشتر توسط دوربین­های CCD که تصاویر دیجیتالی می­گیرند مشخص می­شود. این تصاویر با چگالی سنجی تجزیه و تحلیل می­شوند.

3.     تشخیص رادیواکتیوی: برچسب­های رادیواکتیوی نیازی به سوبستراهای آنزیمی ندارند. در این روش از قراردادن مستقیم فیلم اشعه X پزشکی در مقابل وسترن بلات استفاده می­کنیم و نواحی تیره که معادل باندهای پروتئینی هستند بر روی فیلم ظاهر می­شوند. از آنجایی­که این روش گران است و برای سلامتی مضر است و ایمن هم نیست، استفاده از آن کاهش یافته است.

4.     تشخیص فلورسنتی: پروب­هایی که با فلورسنت برچسب­دار می­شوند توشط نور تحریک شده و توسط دوربین­های CCD مجهز به فیلترهای تشعشعی که تصاویر دیجیتالی می­گیرند، تشخیص داده می­شوند و به ما این امکان را می­دهند تا دادهای بیشتری را از قبیل وزن ملکولی مورد بررسی قرار دهیم. این روش یکی از حساسترین روش­هاست.

تجزیه و تحلیل

در این مرحله باندهای ظاهر شده را با مارکر مقایسه کرده و اندازه آن­ها را تعیین می­کنیم.

 

< ارائه : سرکار خانم آزاده خواجویی >

 


برچسب‌ها: وسترن بلات, نیتروسلولز, الکتروفورز, شناسایی پروتئین, western blot
[ چهارشنبه یکم آذر 1391 ] [ 10:0 ] [ ]
درباره وبلاگ

با سلام
سعی دارم مطالب، ترجمه مقالات و سمینارهایی را که تاکنون خودم و یا سایر دوستان گرامیم در دوران کارشناسی ارشد تهیه نموده ایم رادر این وبلاگ ارائه دهم. هر چند مطالب ارائه شده خالی از نقص نیستند،اما امیدوارم مورد استفاده شما عزیزان قرار گیرند.
(استفاده از مطالب این وبلاگ جهت ترویج علم آزاد است)
لینک های مفید
امکانات وب